生物技術(shù)研究者追求的兩個主要目標(biāo)，一是新型生物產(chǎn)品的開發(fā)，另一就是為傳統(tǒng)的或新生生物產(chǎn)品，尋求更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方式。近十年來，利用遺傳工程技術(shù)來生產(chǎn)一些重要的生物藥物，是生物技術(shù)領(lǐng)域中迅速發(fā)展的一個重要方向。在這一研究領(lǐng)域里，如何創(chuàng)造更經(jīng)濟(jì)、更有效的方法，來提高生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性和產(chǎn)品的市場競爭力，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的科學(xué)家們所關(guān)注的焦點問題。
   利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)重要的生物藥物，在人類文明史上具有劃時代的意義。由于生產(chǎn)成本和生產(chǎn)率的高低直接影響公司的生存，重組生物藥物生產(chǎn)過程的優(yōu)化已經(jīng)成為一個重要問題。它包括以下六個方面∶(1)適宜宿主的選擇；(2)重組蛋白積累位點(如可溶的胞內(nèi)積累、胞內(nèi)聚合積累、周質(zhì)積累或胞外積累)的確定；(3)重組基因最大表達(dá)的分子策略；(4)細(xì)胞生長和生產(chǎn)環(huán)境的優(yōu)化；(5)發(fā)酵條件的優(yōu)化；后處理過程的優(yōu)化。只有這六個方面都以實現(xiàn)高生產(chǎn)率為目標(biāo)，整個生產(chǎn)過程的最優(yōu)化才能實現(xiàn)。

(一)細(xì)胞生長環(huán)境的優(yōu)化策略
要提高細(xì)胞密度和生產(chǎn)率，首先需要對微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化，包括生長培養(yǎng)基的組成，培養(yǎng)物理參數(shù)(pH、溫度和攪拌)及產(chǎn)物誘導(dǎo)條件。優(yōu)化這些參數(shù)的目的在于保證細(xì)胞生長處于最適的環(huán)境條件之下，避免營養(yǎng)物過量或不足、防止產(chǎn)物降解以及減少有毒產(chǎn)物的形成。
1．培養(yǎng)基組成的優(yōu)化
培養(yǎng)基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微營養(yǎng)物如維生素和微量元素，這些營養(yǎng)物的濃度與比例，對實現(xiàn)生產(chǎn)重組微生物的高密度發(fā)酵是很重要的。例如，過量的Fe2+和CaCO3與相對低濃度的磷酸鹽可促進(jìn)黃曲霉生產(chǎn)L-蘋果酸；鏈霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其絲氨酸蛋白酶生產(chǎn)能力可提高10倍之多；在重組微生物達(dá)到高細(xì)胞密度后，限制磷酸鹽濃度可使抗生素和異源白介素b的產(chǎn)率顯著提高。此外還發(fā)現(xiàn)，限制精氨酸的濃度雖然會抑制細(xì)胞的生長，但比起精氨酸充足時細(xì)胞生長優(yōu)良的情況，其重組a-淀粉酶的產(chǎn)量可提高2倍。
培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的種類對重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵也非常重要。一般地，當(dāng)流加培養(yǎng)基中含有酵母膏時，重組蛋白不穩(wěn)定；而當(dāng)流加培養(yǎng)基中含有蛋白胨時，大腸桿菌不能再利用其所產(chǎn)生的乙酸。將酵母膏和蛋白胨都加入流加培養(yǎng)基中，不但所生產(chǎn)的重組蛋白非常穩(wěn)定，細(xì)胞還能再利用代謝合成的乙酸，這是一種非常有趣的代謝機(jī)制。
恒化技術(shù)可用于優(yōu)化精氨酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌X90的生長培養(yǎng)基。使該菌株以0.4 h-1的比生長速率在含精氨酸的基本培養(yǎng)基上生長，待培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，在恒化器內(nèi)分別加入氨基酸、維生素和微量元素來考察這些物質(zhì)對菌體生長和精氨酸合成的影響。結(jié)果表明，由于氨基酸生物合成途徑的末端產(chǎn)物抑制作用，加入某些氨基酸后，細(xì)胞生長反而受到抑制。加入NH4Cl后細(xì)胞量則出現(xiàn)了戲劇性的增長。而添加維生素對菌體生長基本上沒有任何影響。通過計算生物量對每種基質(zhì)的產(chǎn)率，最終可以確定高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，在此優(yōu)化培養(yǎng)基上，大腸桿菌X90細(xì)胞密度可達(dá)到92 g/L，同時形成56 mg/L的胞外重組蛋白酶。
2．特殊營養(yǎng)物的添加
在某些情況下，向培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)物質(zhì)能提高生產(chǎn)率。這些營養(yǎng)物的作用有可能是作為產(chǎn)物的前體，也有可能是阻止產(chǎn)物的降解，例如，在培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(一種由許多芳香族氨基酸組成的蛋白)時添加苯丙氨酸，可將酶的比活力提高大約2倍；在培養(yǎng)重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)b-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸鉀能使重組蛋白的穩(wěn)定性顯著提高。其原因可能是由于宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多種胞外蛋白酶的活性被抑制，從而防止了重組蛋白的降解。
在生長培養(yǎng)基中添加特殊物質(zhì)有時還能以一種未知的機(jī)制提高生產(chǎn)率。例如，在搖瓶培養(yǎng)Micromonospora cbersina時添加碘化鈉可使dynemicin A的產(chǎn)量提高35倍，但在小型反應(yīng)器中卻無法重復(fù)這一結(jié)果。
3．限制代謝副產(chǎn)物的積累
培養(yǎng)條件的控制對代謝副產(chǎn)物的形成影響甚大。在分批或流加培養(yǎng)中，某些營養(yǎng)物的濃度過高均會導(dǎo)致Crabtree效應(yīng)的產(chǎn)生。在這種效應(yīng)下，釀酒酵母會產(chǎn)生乙醇，大腸桿菌則會產(chǎn)生過量乙酸，一旦生成乙酸，細(xì)胞生長及重組蛋白的生產(chǎn)均會受到抑制。大腸桿菌形成乙酸的速度依賴于細(xì)胞的生長速度和培養(yǎng)基的組成。業(yè)已確證，如果在培養(yǎng)基中添加復(fù)合營養(yǎng)物(如大豆水解物)，則會增加乙酸的積累量。針對如何減輕由于乙酸積累而產(chǎn)生的負(fù)面影響，眾多研究者進(jìn)行了大量工作，如利用循環(huán)發(fā)酵技術(shù)來限制乙酸在重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)中的積累。近來也有研究表明，添加某些氨基酸能減輕乙酸的抑制作用。如在培養(yǎng)基中添加10 mg/L的甘氨酸能顯著促進(jìn)大腸桿菌合成重組a-淀粉酶和b-內(nèi)酰胺酶，并能刺激酶從周質(zhì)向培養(yǎng)基中釋放，但此時仍有乙酸伴隨生成。
 

(二)培養(yǎng)模式

由于許多營養(yǎng)物在高濃度下對細(xì)胞有抑制作用，而為了達(dá)到高細(xì)胞密度，又必須供給大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，濃縮營養(yǎng)物必須以與其消耗速率成比例的速度加入反應(yīng)器中。為此產(chǎn)生了多種形式的補料策略，它可以簡單到線性補料，也可以復(fù)雜到利用數(shù)學(xué)模型計算得出的策略來控制補料速率。具體來說，培養(yǎng)模式的選擇主要依賴于以下三個因素∶(1)所培養(yǎng)細(xì)胞的具體代謝行為；(2)利用抑制性底物合成目的產(chǎn)物的潛力；(3)誘導(dǎo)條件以及測量細(xì)胞培養(yǎng)各項參數(shù)的能力。
1．大腸桿菌流加發(fā)酵策略
大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時最關(guān)鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，即使葡萄糖濃度只有0.25～0.5 g/L，大腸桿菌仍會產(chǎn)生乙酸。因此，高細(xì)胞密度發(fā)酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應(yīng)器中底物濃度處于較低的水平。營養(yǎng)物最好以它們的消耗速率加入反應(yīng)器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)。
近年來已經(jīng)報道了多種控制大腸桿菌流加培養(yǎng)中流加速率的方法，其中大多數(shù)是將流加速率與一種物理參數(shù)間接耦合(如溶氧、pH或CO2釋放速率)。有學(xué)者將溶氧控制在一個預(yù)定值上以保證較低的生長速率，結(jié)果乙酸產(chǎn)生很少，最終細(xì)胞干重達(dá)到110 g/L，并發(fā)現(xiàn)較低的比生長速率還有利于重組蛋白的高表達(dá)。在另一個控制低比生長速率的高細(xì)胞密度培養(yǎng)中，研究者采用先指數(shù)流加葡萄糖、銨鹽和無機(jī)鹽，后采用廣義線性流加的培養(yǎng)策略，有效地防止了乙酸的積累，重組大腸桿菌的細(xì)胞密度達(dá)到66 g/L，通過溫度誘導(dǎo)可在胞內(nèi)形成19.2 g/L的活性重組蛋白。
如果將葡萄糖濃度控制在一個不致于產(chǎn)生毒性的足夠低的水平上，也可以使細(xì)胞在不存在限制性基質(zhì)的情況下迅速生長到高細(xì)胞密度。這種控制策略對儀器的要求較高。Kleman等采用在線葡萄糖分析儀，以微生物對葡萄糖的需求來決定葡萄糖和其它營養(yǎng)物的流加速率，這一算法能夠在產(chǎn)物誘導(dǎo)階段中根據(jù)細(xì)胞生長的變化自動調(diào)整流加速率。培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌 MV1190，其質(zhì)粒中帶有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最終細(xì)胞干重達(dá)到39 g/L，產(chǎn)生1.7 g/L可溶的活性蛋白。
2．重組酵母的流加發(fā)酵
酵母中廣泛用于遺傳工程研究的菌株是釀酒酵母。但采用釀酒酵母作為重組宿主也有以下缺點∶(1)重組蛋白生產(chǎn)的水平較低；(2)質(zhì)粒不穩(wěn)定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出現(xiàn)的，因為這會抑制重組蛋白的形成。近來研究表明，其它酵母，如巴斯德畢赤氏酵母也具有作為重組宿主的潛力。Clare等比較了重組巴斯德畢赤氏酵母和釀酒酵母在高細(xì)胞密度狀態(tài)下表達(dá)和分泌鼠表皮生長因子的能力。培養(yǎng)每基因組含有19個拷貝數(shù)的巴斯德畢赤氏酵母，最終可獲得447 mg/L胞內(nèi)重組蛋白；而培養(yǎng)釀酒酵母所獲得的最高水平僅6～7 mg/L。
通過先指數(shù)流加，后采用基于CO2釋放和RQ值的線性流加控制方式可使重組巴斯德畢赤氏酵母的細(xì)胞干重達(dá)到80～90 g/L，并分泌高水平的重組人血清蛋白。而培養(yǎng)釀酒酵母，細(xì)胞干重和重組蛋白的產(chǎn)量僅分別為25 g/L和20 mg/L。即使將釀酒酵母的生長速率維持在0.12～0.18 h-1，也將形成10～13 g/L的乙醇，因而導(dǎo)致產(chǎn)率降低。但釀酒酵母產(chǎn)乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一個復(fù)雜的流加系統(tǒng)，將酵母的生長速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生產(chǎn)最大而乙醇的生成最小。
3．流加培養(yǎng)的控制
一個好的流加控制系統(tǒng)必須避免兩種傾向∶一是流加過量，補料組分在反應(yīng)器中積累從而對細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成產(chǎn)生抑制；二是流加不足，這可能會導(dǎo)致細(xì)胞必需營養(yǎng)物的缺乏。計算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為流加培養(yǎng)的控制提供了更有效的手段。近年來，應(yīng)用計算機(jī)技術(shù)來監(jiān)測和控制發(fā)酵過程的研究屢見報道。由于現(xiàn)代計算機(jī)技術(shù)的幫助，人們能夠采用多種生長參數(shù)和數(shù)學(xué)模型來控制流加培養(yǎng)中營養(yǎng)物的添加，從而使復(fù)雜的控制系統(tǒng)得以實現(xiàn)。在各種人工智能技術(shù)中，模糊推理(fuzzy reasoning)是應(yīng)用最廣的一種。模糊邏輯控制(fuzzy logic control)部分依賴于數(shù)學(xué)生長模型，也采用“語言定義的規(guī)則系統(tǒng)”(linguistically defined rules system)來幫助系統(tǒng)響應(yīng)發(fā)酵過程的非線性和動態(tài)行為。Alfafara等在流加培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的研究中，采用一個模糊邏輯控制系統(tǒng)來控制葡萄糖的流加速度，對系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化后谷胱甘肽的比產(chǎn)生速率達(dá)到6.2 h-1。目前，在流加培養(yǎng)中應(yīng)用模糊邏輯控制技術(shù)的最大問題在于如何減少底物和產(chǎn)物濃度振蕩所需的調(diào)整次數(shù)。自適應(yīng)模糊邏輯控制算法的發(fā)展可望對此有所幫助。

   (三)誘導(dǎo)策略

對于許多帶有誘導(dǎo)型啟動子的重組微生物，只有將生長期和產(chǎn)物形成期分開才能獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養(yǎng)中，這兩段時期的分離可以通過延遲誘導(dǎo)直至細(xì)胞生長已達(dá)到高密度來實現(xiàn)。此外，如果質(zhì)粒穩(wěn)定并且產(chǎn)物對培養(yǎng)物無毒，那么可以用重復(fù)補料分批培養(yǎng)系統(tǒng)來提高生產(chǎn)率。有學(xué)者采用重復(fù)補料分批培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)釀酒酵母，每24 h更換50%的培養(yǎng)基，持續(xù)30 d，其產(chǎn)物(hirudin)的產(chǎn)量可比連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)提高3倍。

如果誘導(dǎo)物和產(chǎn)物對細(xì)胞都有毒性，那么應(yīng)當(dāng)人為地將誘導(dǎo)期和生長期分開。對于這種情況，兩級連續(xù)培養(yǎng)是最適宜的培養(yǎng)方式?？刂频谝还薜臈l件，使細(xì)胞生長處于最適狀態(tài)之下，而誘導(dǎo)與產(chǎn)物形成則發(fā)生在第二罐中。例如，在恒化器中培養(yǎng)一株能產(chǎn)b-內(nèi)酰胺酶的重組大腸桿菌，將第一罐的發(fā)酵液導(dǎo)入第二罐中，構(gòu)成一個兩級培養(yǎng)系統(tǒng)。第二罐中添加營養(yǎng)物以及IPTG作為誘導(dǎo)物。結(jié)果獲得300 mg活性b-內(nèi)酰胺酶(相當(dāng)于總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一系統(tǒng)至少可以穩(wěn)定運行50 d。另一相似的系統(tǒng)被用于培養(yǎng)大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養(yǎng)在恒濁器中進(jìn)行，對第二罐進(jìn)行熱誘導(dǎo)，結(jié)果獲得了比分批發(fā)酵高6倍的比生產(chǎn)率。研究者還嘗試將生產(chǎn)重組蛋白的兩級連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)與親和色譜柱相組合，試圖實現(xiàn)重組蛋白生產(chǎn)和純化的連續(xù)化。但由于技術(shù)上的一些原因，這種組合還未得到成功。
比生長速率對細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成均有重要作用。經(jīng)常會遇到的情況是，最適于細(xì)胞生長的比生長速率卻并不適于產(chǎn)物的形成或其它特性的實現(xiàn)。我們在培養(yǎng)面包酵母時發(fā)現(xiàn)，比生長速率為0.2 h-1時細(xì)胞產(chǎn)率最高，而比生長速率為0.178 h-1時酵母發(fā)酵活力最佳。針對這一現(xiàn)象我們提出了一個兩階段控制比生長速率的流加培養(yǎng)策略，結(jié)果在一個反應(yīng)器中實現(xiàn)了高發(fā)酵活力與高細(xì)胞產(chǎn)率的統(tǒng)一。 (四)細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵 從反應(yīng)器角度來考慮獲得高細(xì)胞密度，通常采用的是細(xì)胞循環(huán)生物反應(yīng)器。這種反應(yīng)器利用一種切向流或中空纖維過濾器從醪液中分離細(xì)胞，細(xì)胞返回容器，無細(xì)胞醪液則以給定速率連續(xù)轉(zhuǎn)移，同時代之以新鮮培養(yǎng)基。利用細(xì)胞循環(huán)技術(shù)，可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器中并達(dá)到高細(xì)胞密度，而毒性廢產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物則不斷轉(zhuǎn)移，這可以延遲或防止由細(xì)胞生長或產(chǎn)物形成引起的反饋抑制。細(xì)胞循環(huán)生物反應(yīng)器能夠適用于多種機(jī)體和生產(chǎn)系統(tǒng)，但它的應(yīng)用也存在許多限制，主要包括∶(1)作用于進(jìn)入過濾單元的細(xì)胞的剪應(yīng)力太大；(2)系統(tǒng)的放大存在許多實際困難。
操作細(xì)胞循環(huán)生物反應(yīng)器時必須考慮兩個因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環(huán)速率(指通過過濾系統(tǒng)的培養(yǎng)基速率)。稀釋率的大小影響細(xì)胞的生長速率，不同的實驗?zāi)康膶ο♂屄实囊笠膊煌?；高的循環(huán)速率可使組分混合均勻，特別適用于細(xì)胞容易凝聚或成團(tuán)的情況。但循環(huán)速率過高會使作用在細(xì)胞上的剪切力過高，也會導(dǎo)致過濾單元膜的迅速損壞。因此，很難同時確定合適的稀釋率與循環(huán)速率，這也是限制細(xì)胞循環(huán)技術(shù)應(yīng)用的一個重要因素。
細(xì)胞循環(huán)技術(shù)可望獲得高的體積生產(chǎn)率，這對產(chǎn)物的提取非常有利。近年來循環(huán)發(fā)酵技術(shù)已廣泛用于生產(chǎn)細(xì)胞代謝物，如燃料酒精和有機(jī)酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵技術(shù)，重組大腸桿菌細(xì)胞干重達(dá)到145 g/L，其重組青霉素?；干a(chǎn)率比分批培養(yǎng)提高了近10倍。對于活細(xì)胞即為所希望的產(chǎn)物的培養(yǎng)，細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵也能發(fā)揮作用。如在食品工業(yè)中，為生產(chǎn)牛奶，奶酪和酸乳酪需培養(yǎng)不同的乳桿菌，采用細(xì)胞循環(huán)生物反應(yīng)器可以很容易地提高這些生物體的的密度。
在多種控制手段的幫助下，目前人們已經(jīng)能很容易地獲得超過100 g/L的細(xì)胞密度。但已有的研究結(jié)果表明，與最適生物量形成所對應(yīng)的生長條件通常會導(dǎo)致較低的比生產(chǎn)率。例如，用細(xì)胞循環(huán)反應(yīng)器生產(chǎn)2,3-丁二醇，生物量提高了大約6倍，但體積生產(chǎn)率只提高了2～3倍。同樣，流加培養(yǎng)可以使鏈霉菌的細(xì)胞干重達(dá)到43 g/L，但蛋白酶活為零，而當(dāng)細(xì)胞干重為18 g/L時蛋白酶活卻高達(dá)3500 U/mL。我們在研究中也經(jīng)常遇到類似問題。要解決這一問題，一方面應(yīng)當(dāng)研究如何促進(jìn)重組蛋白的高效表達(dá)和提高重組菌株的穩(wěn)定性，另一方面要研究與高細(xì)胞密度相關(guān)聯(lián)的高水平產(chǎn)物的形成條件。